關于生化儀測試結果問題的分析
2017-07-28

生化儀的結果問題,一般分為如下幾個方面:

準確度問題:結果有重復性,但離質控或校準液的靶值相去甚遠,也就是常說的偏低偏高做不準。


精密度問題:就是沒有重復性,也就無所謂準確度了,每次測試的結果都差的很遠,相互不挨著,CV%變異系數遠遠高出標準或廠家標稱或能接受的范圍。


線性問題:也就是高值不高,低值不低,中間值反而很好。有時做同標本比例稀釋,結果不符合計算結果。


校準問題:校準失敗是最令人惱火的,也是全部工作的第一步,這一步不過談不上質控和標本測試。


質控問題:失控也是結果問題之一。


頻繁偶發問題:偶發性的失控,有時會由于重新校準而暫時緩解。突發性的標本結果混亂,可能是同日一批標本中的幾個,也可能是某日的一批標本,但經過重測后都會等到另外一個結果。


病理原因:這個是最希望見到的,標本因為病理原因而不正常,但有時實驗室反而會讓人作出解釋。


大部分人都把結果問題簡單的歸結到應用方面,其實具體統計來看,絕大部分是維修問題,真正的應用非常少。


大多數應用人員對上述問題的對策大致如下:


重新校準,又是會因為校準失敗而去掉一點或多點;


更換項目通道;


更換試劑位置;


更換檢測位置,比如雙圈反應盤的,由自動分配改為內圈或外圈;雙套試劑針雙圈試劑盤的,改為其中的一套。


更換新的批號試劑、校準、質控品,重新來過。


這些措施中,無異e的方法最為合理,但也只能排除試劑、校準和質控的問題。最近一年來,這7大類問題十分突出,根源就在于生化儀器本身的特殊性,應用和維修界限不明確,卻非要人為的嚴格劃分。


一般結果問題的最終原因,分為參數原因、儀器原因和試劑原因三類,下面著重分別闡述。


參數原因:


參數設置有誤,將會直接導致準確度問題、線性問題、校準問題和質控問題,當然也會導致部分的病理原因和偶發型問題。


首先是測試方法的選擇。


例如終點法和速率法的選擇錯誤,可能會導致負值的出現,特別是速率法的項目選擇成為終點法,負值的可能性很大。


圖1反應曲線示例



在圖1中,AB線段是可能的R1+S的反應曲線,C線段是可能的加入R2后的反應曲線。


如果是終點法反應,應該選擇End(或End1,根據機型不同),可以是一點終點法(1-point),也可以是兩點終點法(2-point End)。大部分機型對此的選擇并不是在測試方法上,而是在讀點上,設置了空白點,那就是兩點,僅設置了終點讀點,那就是一點。


如果是一點終點法(1-point),那么讀點應該是Z,Z的吸光度值減去杯空白或者水空白或者試劑空白抑或是0,進行計算后就是用于濃度活性計算的吸光度。這種方法與R1+S的反應曲線無關,但由于沒有扣除R1+S的空白,忽略了干擾物的影響,可能會導致結果的假性偏差(校準和質控可能會體現不出來,但在線性問題上會表現的很明顯)。這就是兩點終點法的優勢所在。


如果使用兩點終點法(2-pointEnd),那么讀點應該是W和Z。圖1是上升反應的例子,真正的反應吸光度應該是Z-W,當然還應該減去相應點的試劑空白或者杯空白(水空白)。如果是B線和C線的結果,沒有問題,肯定是正值,也是真正的反應差值。而A線和C線就出現麻煩了,會出現負值。


對此的解釋有這么幾個方面,首先可能是樣本干擾物質的影響,比如LIH樣本等;其次是試劑處理能力太差,干擾物質稍微多一點就無法處理;再者就是方法選擇錯誤,根本不能用終點法來測試。


如果方法正確,那么遇到這樣的結果就要稀釋重測,也可以設置一些LIH或前帶監測之類的報警提示。但若是試劑能力問題,很不好辦,畢竟都要靠試劑吃飯,能用也得用,不得用也得想辦法用。所以就修改讀點,將W和Z的讀點改為X和Z或者Y和Z,這樣就永遠不出負值。這就引出來一個另類的測試方法:兩點法(2-Point)或者叫固定點法(Fixed)。這類方法不論反應趨勢是終點還是速率,只要給出兩點,就利用差值進行計算濃度活性。這也就是我們熟悉的免疫比濁類的項目,特別是含有乳膠的,反應曲線的趨勢不是那么特異,既不像終點也不靠速率。


有些儀器是有兩點法(2-Point)或者固定點法(Fixed)的方法選項,有些儀器沒有,只有終點和速率,那么就用終點法來進行讀點的選擇。這類的方法的讀點應該選擇在X和Z上,注意Z點的明顯下沉,這樣才是真正的反應差值,而W和Z并不是真正的反應差值,Y和Z就更不是了。


但很多項目并沒有X點的下沉趨勢,直接就是Y點到Z點,這就不應該選擇兩點法(2-Point)或者固定點法(Fixed)了,而堅持應該用兩點終點法(2-point End)。因為那樣做的話,不同的標本Y點和Z點的差值不同,幾乎是濃度活性越高差值越小,導致假性結果,甚至影響到校準失敗,質控不好,線性很差,甚至會影響到精密度。


如果是速率法(Rate)或者兩點速率法(2-PointRate),讀點應該在X和Y之間選擇,速率法(Rate)是要驗證線性的,兩點速率法(2-Point Rate)對線性不那么嚴格。當然還有Rate1這些方法的選擇,區別僅僅是扣除的是杯空白還是試劑空白還是某一段反應曲線的吸光度值。但讀點如果選擇W和Y或者W和Z,不僅可能出現負值甚至線性報警,校準和質控可能都會存在問題。


而校準參數的設置,往往是導致校準失敗或準確度差的主要原因,甚至也會影響到線性。


圖2校準曲線示例





校準方法分為兩類,線性和非線性。圖2中A和B線屬于線性校準,一般是兩點線性,也就是兩點決定一線,當然還有多點線性,這個很少用到,不做說明。


線性校準最少要給出兩個點的濃度值,A線是過原點O的,在很多機器的設置中單列了一種校準方法,比如奧林巴斯的AB校準方法,就是假設校準曲線經過原點O,所以給出一個Z點就可以畫出這條直線。而在其它機器,或者奧林巴斯的AA方法中,就要給出兩個濃度點,才能畫出B線。當然第一個濃度點可以用去離子水替代,濃度是0,也就是水點,再給一個濃度點Z,就可以描繪出B線?;箍梢愿鲆桓鯶點和WXY中的任意一點,兩點也能決定一線,然后直線兩端無限延伸,最終會交于縱軸。


A線和B線會有一個截距和斜率上的差異,都能通過校準和質控,也會在精密度和準確度上保持良好的線性,但在大尺度的比較中,會有些許差異。所以在是否過原點的選擇上,沒有太明顯的差異。


線性校準引發的結果問題,大多是因為校準液的選擇和放置出錯,濃度不對導致校準曲線斜率偏差太大,線性很差。


非線性校準常用的是對數曲線和樣條曲線,對數曲線有很多種,例如Log3,Log4,Log5等。當然還有其他的非線性校準曲線,例如折線曲線,指數曲線等等,很少用到。


非線性校準需要2個以上的校準液才能實現,一般都是5個以上。由于非線性校準的特殊性,在最高和最低濃度點之間的結果可以得出準確的數值,超過這個范圍就無法進行計算,它不能像直線那樣延伸。所以遇到這種情況,儀器會提示,操作人員也會進行自動或人工稀釋重測。


在很多機型中,多點非線性校準被看做是多段直線的組合,所以會在校準結果上出現每兩個點之間的斜率,這只是擬合方法的問題。


在非線性校準中,一般給出一個零濃度點,也叫水點,但這一點不一定在原點O上,可能在縱軸上形成一個截距。理論上講,多點校準的校準液濃度最好是梯度倍比關系,這樣會充分的保證各段線性。但實際上并非如此,無論是校準品的制作,還是試劑廠家為了擬合預設的校準曲線,還是為了盡可能的擴大最大檢測范圍,各點校準品往往不是這個關系。


圖2中的C是樣條曲線,D是對數曲線,可以看出在中間段二者的背離是相當明顯的,而在兩端的背離不是那么顯著。


廠家給出的多點校準液一般是4-5種,加上自制的水點,那就是5-6點,根據廠家預設的校準曲線,比如是Log4測試,會得到很好的Log4曲線。而用最高濃度點進行梯度倍比稀釋的話,可能會是樣條或者Log3甚至是Log5這樣的曲線。這樣就產生一個問題,那就是校準能通過,質控也可能很好,結果大部分不錯,但在線性驗證時會出現某一段范圍的背離,與計算值差別太大。特別是與其他設備進行對比時,甚至是參加室間質控時尤為明顯。


所以校準方法的選擇,不能照搬教條,也要根據實際情況作出修正。但有一點可以肯定,校準參數不會影響到精密度,也就是說不會重復性不好。


至于其他的參數,比如吸光度范圍設置,線性范圍設置,前帶或者LIH樣本設置,讀點前移探測等等,因為這些參數設置導致的校準失敗或者結果旗標甚至屏蔽,根據不同的機型旗標提示說明,作出相應的應對就行了,大不了全部放到最大,不監測試試就知道了。


但生化結果不好有個判斷原則,就是單一項目不好檢查該項目的參數設置校準等;同類項目不好就要檢查儀器,偶發性的無固定項目結果不好,也要找儀器原因。


儀器原因


水質原因


去離子水的好壞直接影響結果,除了水機的過濾器和防滲膜需要檢查更換外,消毒裝置的好壞也抑菌殺菌的關鍵,大多數水機都會進行定期的各種過濾器更換,但很少注意消毒器的檢查和更換,比如臭氧發生器或紫外消毒器,很多早已失效,根本沒有殺菌消毒功能。


如果過濾不好或者有細菌存在的水進入生化儀,會直接影響清洗效果,反應杯洗不干凈的后果相必都知道,引發隨機性的結果問題,因為R1+S的空白就不對了。水浴的儀器會造成孵育槽細菌沉積,影響光路本底甚至是檢測隨機問題。而且對離子類項目或某些項目的影響是致命性的。


光路問題


光源性能下降會導致某些波長的項目出現問題,有時因為光源不穩導致隨機無規律的結果問題和怪異曲線。而光度計問題也會造成此類故障,特別是某一波長的電路問題。光窗的污染也是原因之一。


機械定位問題


各針(樣品針、試劑針、攪拌針棒、沖洗站各針)在反應盤、樣品吸樣位置和試劑位置的偏差會導致各種各樣的結果問題,引發精密度差。有時定位誤差是隨機的,導致結果的偶發性問題。


壓力問題


純水供水壓力、脫氣水壓力、清洗劑提供壓力、各種負壓、廢液抽取壓力的不足或者過大,都會導致項目間的污染,而且是隨機的無規律的。壓力過大會導致飛濺,壓力過小會導致清洗不足,甚至會產生漫盤。而各種壓力的不足或過高,并不是所有儀器都會報警的,比如沖洗水的壓力很多儀器都沒有監測,只提供了驗證方法,一般是檢查反應杯的吐水量和各針的吐水量。而抽取負壓的不足不一定是在總負壓罐上形成的,而是在末端的某個環節上產生的,導致抽取廢液不干凈,從而影響結果,這一點上,沒有哪個機器能徹底杜絕。只是通過設計的冗余來預防。這也是儀器污染的主要原因。


大家都知道,沖洗站的抽水吐水不足,會導致結果問題。而樣品針、試劑針和攪拌棒的沖洗水流不足,也會導致相應的問題。


圖3各針沖洗水壓示例




圖3中,A和D是標準水壓,B和E都是壓力過大,造成飛濺;C和F是水壓過低導致清洗不足。因此造成的結果問題是最容易被忽視的。長期的清洗不足,在針尖處能看到與針后端顏色不一致的變色,明顯針尖處的顏色發暗、粗糙。很多人都注意針內壁的沖洗,而對外壁往往忽視。少數的機器可以調整外壁沖洗水壓,大部分則不能。奧林巴斯那種漫灌式的清洗真的問題很多,而且束手無策。


污染問題


這是生化儀的性質決定的,就這么幾個部件(反應杯、樣品針、試劑針、攪拌針、沖洗站),還都不是一次性的,無論事前事后怎么清洗,無論是加熱清洗,清洗劑清洗然后再純水沖洗,無論是鏡面處理還是鍍膜處理都無法保證絕對清潔干凈,只是最大限度的預防污染。


污染問題一般是有壓力、試劑、清洗和位置這幾個原因導致的。而杜絕污染的根本措施就是日常保養和檢查,如果忽視了這一點,等發現問題所在再去處理,一切糾紛早已出現,什么都晚了。


這里只列舉幾個例子:




圖4針棒的污染示例


圖4是樣品針和試劑針以及攪拌棒上的污染,特別是后者,簡直觸目驚心,這些污染物進入正常的反應過程,對反應結果的影響可謂是巨大的隨機的。造成這樣的現象,標本采集處理是否標準、試劑是否可靠、清洗效果是否良好以及日常的保養是否到位都是關鍵,而且是有前后順序的。


各針的針尖針壁掛液,就說明有污染附著,沖洗液不能順利的流過,清洗效果自然很差。而在沖洗站上,各針掛液滴液,而且掛液滴液針都是隨機的,基本上都是污染物附著所致,當然有些機器的特殊結構也會造成掛液,但絕對不能滴液。


在各針的運動軌跡上,見到污染物滴落的痕跡,就已經說明堵塞污染有多么嚴重,這樣的機器任你試劑再好,參數再準確也做不出好的結果。這也就是應用工程師百思不得其解,維修工程師一聽新上項目就推到試劑上的原因所在。累死應用閑死維修的原因往往是應用只針對自己的項目,其它項目其實也不好,但沒有發言權,而且驗證模式和方法也不科學,匯報給維修人員很容易被抓住把柄。


一般的操作和應用人員對試劑針和樣品針的吐水情況都非常注意,纖細的直線噴水被認為是可靠的,而發散歪斜的噴水被認為是堵塞或損傷,這是有道理的。


圖5針吐水情況示例



其它儀器問題


例如液面探測的誤判導致的結果問題是常見的,除了硬件損壞或實驗室環境因素外,樣品或試劑上泡沫也是誤判的主要原因,而應用只能判斷和解決后者,對前者無能為力。


還有就是定量問題,注射器、脫氣水的好壞都是導致定量問題的主要問題,當然管道破損也是原因之一,還有閥的故障等等。這類故障除非特別明顯,否則肉眼很難察覺。


試劑問題


個人不想對試劑問題作出什么言論,其實很簡單,換一家的試試就知道了。很多試劑的處理能力不足,正常標本還行,高值和低值的很難做好,這個想必大家都明白怎么回事。